东北师范大学研究生(东北师范大学研究生院)



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摘要

虽然基于比色的测定法在即时检测 (POCT) 中非常方便地确定生物标志物,但它们通常会受到从全血样本中分离血浆或血清的预处理程序的影响。该文报告了一种简单的比色纸基分析设备 (c-PAD),它能够通过将全血样本直接滴在纸上来进行样本到答案的分析。这是通过利用海藻酸钠水凝胶来实现的,海藻酸钠水凝胶具有纳米级多孔结构,可有效阻止大红细胞和血红蛋白分子的通过,封装酶和显色试剂。当血液样本中的小目标进入传感区域触发显色反应时,智能手机会记录由此产生的颜色信号。无需任何分离过程,即可完全避免红血对颜色信号的干扰。该方法的分析性能通过测定真实血液样品中的葡萄糖来评估。结果表明,可实现快速准确的分析,检测限低至 0.12 mM。此外,通过制造具有多个传感区域的 c-PAD,可以实现全血中不同目标(葡萄糖、胆固醇和甘油三酯)的同时检测。由于其几个基本优点,包括极其简单的制造程序、无需繁琐预处理的样本到答案分析以及进行高通量分析的能力,所提出的 c-PAD 将在全血样本的 POCT 应用中具有重要价值。

介绍

基于比色反应的分析方法是一种非常简便的现场即时检测(point-of-care testing,POCT)方法,在生物靶标物的快速测定中具有重要的应用。对于POCT中经常使用的血液样品,其中的红细胞和血红蛋白分子将严重干扰显色反应,影响小分子靶标物的测定,因此需要借助离心分离等手段从全血样品中分离血清或血浆,这种预处理过程无疑限制了快速检测的效率和准确性。

近期,东北师范大学杨丽教授课题组开发了一种基于水凝胶的比色纸基分析系统 (colorimetric paper-based analytical device,c-PAD) 很好的解决了这一问题。该方法利用生物酶诱导海藻酸钠水凝胶,形成纳米量级网络状结构,包覆酶(如GOx、HRP)和显色试剂(如TMB)实现靶标物的显色反应测定(如将无色的TMB变成了蓝色的TMBox),同时利用其纳米尺寸筛选效应,有效地阻止血液中红细胞(7-8 μm)和血红蛋白(5-6 nm)等大分子通过,从而实现全血中生物小分子的原位无分离检测。所制备的c-PAD具有制作过程极其简单、无需繁琐的前处理即可实现血样的一步分析、高通量分析等优点。

图1. 高通量水凝胶c-PAD的制备与检测示意图。(A) 水凝胶c-PAD的制备。(B) 水凝胶c-PAD检测人全血中葡萄糖的工作原理。(C) 用智能手机和颜色识别软件进行数据采集和分析。图片来源:Anal. Chem.

值得一提的是,该 c-PAD可根据包埋的酶和显示剂不同,制备多个不同的传感区域, 实现对不同靶标物的同时检测。如图2展示了一个具有9个传感区域的 c-PAD,可对同一份全血样品中的甘油三酯、葡萄糖和胆固醇三种不同目标物的含量实现同时测定, c-PAD的正面显示的都是留在滤纸表明的血液大分子的颜色,而背面则呈现不同的颜色信号,从而得到不同靶标物的含量。研究结果表明,该水凝胶 c-PAD具有广泛的适用性,对血液样品中各种生物分子的POCT具有实际应用价值。

图2. (A-B) 同时检测全血中胆固醇((A,1), (B,1),和(C,1)),葡萄糖((A,2), (B,2),和(C,2))和甘油三酯((A,3)、(B,3)和(C,3))。(C-D)分析信号与血液中甘油三酯、葡萄糖、胆固醇浓度的半对数图。

图 3. (A) 不同反应 条件下水 凝胶c-PAD 显色区域的颜色强度图:[GOx] = 60 U/mL,[HRP] = 60 U/mL,[TMB] = 14 mM,[ 葡萄糖] = 10 mM,V =20 μL。稀释全血中的葡萄糖浓度为 10 mM。误差条代表六次平行测定的标准偏差。(B-D) 清洁定性滤纸(原始亲水区域)、疏水区域(蜡改性区域)和传感区域(藻酸盐水凝胶改性区域)的 SEM 图像。(E-G) 空白定性滤纸分离后和水凝胶 c-PAD 分离后未经任何处理的 5% 全血的光学显微镜图像。(H) c-PAD 分离前后全血样品的紫外吸收光谱。

图 4. 分析信号与 PBS 缓冲液 (A) 和含全血葡萄糖 (B) 中葡萄糖浓度的半对数图。

图 5. 此方法与血糖仪在监测健康人餐前和餐后血糖浓度方面的比较 (A)。Bland-Altman 分析对健康人在饭前 (B) 和饭后 (C) 进行的拟议测定与血糖仪测试之间的一致性。

总结

团队提出了一种用于全血样品 POCT 的新型海藻酸盐水凝胶比色纸基分析装置。该方法的性能是通过分析血糖来评估的。藻酸盐水凝胶的三维网络结构不仅可以为显色反应提供足够的微反应空间,还可以提供尺寸筛分,有效阻止红细胞和血红蛋白的通过,让小分子自由通过。由于所提出方法的优点,无需任何预处理过程即可实现人全血中葡萄糖(以及胆固醇和甘油三酯)的直接检测。我们的方法可以扩展到检测全血中的其他小分子,因此在 POCT 中具有更广泛的适用性。

相关成果以题为 Hydrogel Paper-Based Analytical Devices: Separation-Free In Situ Assay of Small-Molecule Targets in Whole Blood发表在《 Analytical Chemistry》第一作者为东北师范大学化学学院 徐嘉博士生通讯作者为东北师范大学 杨丽教授参考文献doi.org/10.1021/acs.analchem.1c03347。

导师简介

杨丽,女。东北师范大学化学学院,教授,博士生导师。2002年毕业于中国科学技术大学,获博士学位,其后在欧洲和美国研究机构从事博士后研究工作,2008年以优秀学术骨干引进东北师范大学。主要研究方向为发展以毛细管电泳/电色谱为基础的复杂样品和痕量物质的分离分析技术。至今已在Anal. Chem., ACS Sensors,Biosens. Bioelectron., Anal. Chim. Acta,Talanta, J. Chromatgr. A等刊物上发表SCI 收录论文80余篇,主持国家基金委、教育部、吉林省科技厅等多项科研项目。

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